Receptory insuliny w izolowanych ludzkich adipocytach. Charakteryzacja poprzez etykietowanie fotoinwinterii oraz dowody na internalizację i przetwarzanie komórkowe.

Dokonaliśmy fotolabelingu i scharakteryzowaliśmy receptory insuliny w izolowanych adipocytach od normalnych ludzi, a następnie zbadaliśmy los komórek wyznakowanych kompleksów insulino-receptorowych w temperaturach fizjologicznych. Biologicznie aktywna światłoczuła pochodna insuliny, insulina B2 (2-nitro-4-azydofenyloacetylowa) des-PheB1 (insulina NAPA-DP) została wykorzystana do oznaczenia fotoznaczników jako receptory insuliny, a specyficznie wyznakowane białka komórkowe zostały zidentyfikowane przez dodecylosiarczan sodu elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (SDS-PAGE) i autoradiografia. W stężeniach wysycających wiązanie insuliny 125I-NAPA-DP z izolowanymi komórkami tłuszczowymi w 16 ° C było szybkie (w połowie maksimum w około min i maksymalnie w około 10 min), a około 25% swoiście związanego ligandu było kowalencyjne. połączony z komórkami za pomocą 3-minutowej ekspozycji na światło ultrafioletowe o długich falach (366 nm). Analiza fotolabelkowanych białek komórkowych przez PAGE pod nieobecność reduktantów dwusiarczkowych ujawniła specyficzne oznakowanie głównego pasma białkowego o wartości 330,000 i dwóch mniej intensywnych pasm o wielkości 295 000 i 260 000. Po redukcji dwusiarczkowych wiązań z ditiotreitolem, wszystkie trzy nieredukowane formy receptora insuliny zostały przekształcone w duże oznaczone jako Mr-125 000 i mniej intensywnie wyznakowane Mr-90,000. Znakowanie podjednostki receptora Mr-125000 było nasycalne, a natywna insulina świńska skutecznie hamowała (połowa maksymalnego hamowania przy 12 ng / ml) fotolabelingu tej wiążącej podjednostki przez insulinę NAPA-DP. Gdy nienaruszone adipocyty fotolabelowane w 16 ° C (temperatura, która hamuje endocytozę) zostały natychmiast trypsynizowane, wszystkie znakowane prążki receptora przekształcono w fragmenty tryptyczne o małej masie cząsteczkowej, co wskazuje, że w 16 ° C wszystkie znakowane kompleksy insulino-receptorowe pozostały na powierzchnia komórki. Jednakże, gdy fotolabelowane komórki były dalej inkubowane w 37 ° C, a następnie trypsynizowane, część znakowanych receptorów stała się niewrażliwa na trypsynę, wskazując, że ta frakcja została przeniesiona do wnętrza komórki, a zatem była niedostępna dla trypsyny w pożywce inkubacyjnej. Wewnątrzkomórkową translokację wyznakowanych receptorów obserwowano w ciągu 2 minut, która stała się w połowie maksimum o 10 minut, a maksymalna o około 30 minut inkubacji w 37 stopniach C. Występowała również komórkowa obróbka zinternalizowanych kompleksów receptor insuliny, ponieważ inkubacja w 37 stopnie C (ale nie 16 ° C) spowodowały wytworzenie składnika Mr-115 000 ze znakowanych receptorów. Włączenie chlorochiny, leku o właściwościach lizosotropowych, w pożywce inkubacyjnej spowodowało zależny od czasu wzrost (maksymalny wzrost o 50% powyżej kontroli o 2 godziny w 37 ° C) w wewnątrzkomórkowej puli wyznakowanych receptorów W przeciwieństwie do tych wyników w ludzkich adipocytach, nie obserwowano znaczącej internalizacji kompleksów insulino-receptorowych i braku efektu chlorochiny w hodowlach ludzkich limfocytów IM-9 podczas 1-godzinnej inkubacji w 37 stopniach C. Doszliśmy do wniosku, że w izolowanych ludzkich adipocytach: ( a) struktura podjednostek receptorów insuliny jest taka sama jak podana dla kilku innych tkanek, (b) kompleksy insulino-receptorowe są szybko internalizowane i przetwarzane w temperaturach fizjologicznych, oraz (c) komórkowa obróbka kompleksów receptor-receptor zachodzi przy jednym lub więcej wrażliwych na chlorochinę miejsc wewnątrzkomórkowych .Images
[podobne: spastyka, skrzydlik, wadowice olx ]