Kliniczne znaczenie minimalnej choroby resztkowej u dzieci z ostrą białaczką limfoblastyczną ad

Ponowne uporządkowanie genów receptora komórek T TCR (V1-J1,2, V1-JP1,2 i V9-J1,2) i TCR. (V2-D3, V1-J1, D2-D3 i V2-J1) poszukiwano w próbkach otrzymanych w chwili rozpoznania.11,14 Jeśli nie wykryto żadnego z tych rearanżacji, poszukiwano rearanżacji genu ciężkiego łańcucha immunoglobuliny (IgH) za pomocą konsensusowych starterów FRIII i JH.15 Obecność lub nieobecność takich klonalnych markerów określono po elektroforezie w żelu poliakryloamidowym. Odrębne prążki produktów PCR odpowiadających rearanżacjom klonalnym zostały zsekwencjonowane. Sondę oligonukleotydową specyficzną dla sekwencji łączącej zsyntetyzowano dla każdego przegrupowania. Testy na obecność choroby resztkowej przeprowadzono poprzez amplifikację PCR 2 × 105 komórek jednojądrzastych szpiku kostnego w próbkach uzyskanych podczas remisji, przy użyciu zestawu starterów odpowiadającego klonalnej reorganizacji komórek T lub komórek B zidentyfikowanej w momencie diagnozy. Produkty PCR były przenoszone za pomocą kropek i hybrydyzowane z radioznakowaną sondą specyficzną dla klonów.11 Wszystkie zamrożone próbki uzyskane we wszystkich punktach czasowych od danego pacjenta były prowadzone w tym samym czasie. Swoistość wykrywania sprawdzano dla każdej sondy na co najmniej dwóch różnych próbkach poliklonalnych. Czułość każdej sondy oceniano, testując seryjne rozcieńczenia blastów pacjenta w mieszaninie komórek jednojądrzastych poliklonalnych szpiku kostnego. Mediana poziomu wykrywania wynosiła 5 x 10-5 (tj. 5 blastów na 100 000 normalnych jednojądrzastych komórek). W przypadku analiz statystycznych wyniki uznano za ujemne tylko wtedy, gdy wykrywany poziom był mniejszy niż 1,5 x 10-4.
Do oceny ilościowej blastów użyto konkurencyjnego testu PCR. Amplifikację prowadzono tak jak w przypadku wykrywania blastów w obecności 100 kopii wzorca wewnętrznego w każdej próbce PCR. Wewnętrzne standardy składały się z DNA z komórek monoklonalnych, które miały przegrupowanie obejmujące te same segmenty genomowe co blastery pacjenta, ale z odrębną sekwencją łączącą. Każda seria PCR obejmowała seryjne rozcieńczenia blastów pacjenta. Produkty PCR hybrydyzowano w dwóch powtórzeniach z sondami swoistymi dla klonów odpowiadającymi podmuchom pacjenta i standardowi wewnętrznemu. Obliczono stosunek radioaktywności dwóch sond. Krzywa kalibracji została sporządzona na podstawie wyników otrzymanych dla seryjnych rozcieńczeń. W próbkach otrzymanych podczas remisji uzyskano liczbę blastów na 100 000 jednojądrzastych komórek szpiku z krzywej kalibracyjnej. Testy replikacji dały wyniki z odchyleniem standardowym wynoszącym od 15 do 30 procent wartości średniej. Gdy przeanalizowano dwa różne markery (np. Jedno przegrupowanie TCR. V2-D3 i jedno przegrupowanie TCR. V9-J1) w celu ilościowego oznaczenia resztkowych komórek białaczkowych w tej samej próbce, wyniki były ściśle skorelowane (współczynnik korelacji dla 28 próbek, 0,94).
Projekt badania
11 ośrodków uczestniczących w badaniu zapisało wszystkich swoich pacjentów w momencie rozpoznania, po uzyskaniu świadomej zgody. Próbki szpiku kostnego od wszystkich pacjentów uzyskano w momencie rozpoznania i po zakończeniu terapii indukcyjnej. W grupie ryzyka standardowego próbki uzyskano po zabiegach konsolidacji, interwału i opóźnionej intensyfikacji
[patrz też: bromazepam, chloramfenikol, noni ]
[przypisy: świadomy sen techniki, symbole chorób, moj olx zaloguj ]